强直性肌营养不良 1 型（DM1）是一种复杂的遗传性疾病，主要由肌营养不良肌强直蛋白激酶（DMPK) 基因 3’非编码区的 CTG 重复扩增引起的。DM1 疾病表型，严重程度和发病年龄变异性极高，主要症状包括肌强直、肌肉萎缩、肌无力、心脏传导缺陷、白内障和胰岛素抵抗等。2020 年 2 月 5 日，QY球友会客户中科院上海生化细胞所的李劲松及胡苹研究团队在 Cell Research 上联合发表了题为“Dosage effect of multiple genes accounts for multisystem disorder of myotonic dystrophy type 1”的研究论文。研究人员利用半克隆技术将带有突变 Dmpk、Six5 和 Mbnl1 的单倍体胚胎干细胞注射到小鼠卵母细胞中，建立携带多基因杂合突变的小鼠模型来模拟多基因剂量的减少，为开展 DM1 致病机制和药物筛选研究提供了新模型。

研究人员首先通过半克隆技术结合 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，成功构建了 Dmpk、Six5 和 Mbnl1 杂合突变的孤雄单倍体胚胎干细胞（AG-haESCs），并通过 ICAHCI 技术注入卵子进而一步获得 Dmpk、Six5 和 Mbnl1 三基因杂合突变的半克隆小鼠模型。全基因组测序分析结果显示没有脱靶效应，表型分析显示该半克隆小鼠产生了肌无力、肌萎缩、严重运动障碍、呼吸和消化功能紊乱等典型的 DM1 表型，但没有先天性 DM1（CDM）的表型，提示其他基因的剂量变化可能与此相关。

Dmwd 参与 DM1           

根据已有研究结果，Dmpk 中 CTG 重复序列的扩增会通过改变局部染色质结构产生等位基因特异性作用，下调 Dmpk 两个相邻基因 Six5（Dmpk 的下游）和 Dmwd（Dmpk 的上游）的表达。研究人员通过 CRISPR-Cas9 技术构建 Dmwd 突变细胞并注入小鼠体内，表型分析显示 Dmwd 突变小鼠肌纤维 CSA 显著降低，但其他 DM1 表型未被观察到，提示 Dmwd 突变会影响 DM1 表型，但不足以解释 DM1 的所有复杂多系统症状。

四基因杂合突变模型分析            

研究人员进一步构建了 Dmpk、Six5、Mbnl1 和 Dmwd 四基因杂合突变的小鼠模型，以了解更多的 DM1 症状。脱靶分析显示在被测细胞中没有新的突变位点，表型分析显示四基因杂合突变小鼠有先天性 DM1 表型，22% 小鼠在出生后数小时内死亡，其主要原因是膈肌发育异常导致的肺扩张失败。存活小鼠有严重的肌强直、肌无力、肌肉萎缩和运动缺陷等一系列典型的 DM1 表型。上述结果表明 Dmwd 参与其中的多基因剂量减少是 DM1 表型产生的主要原因。

基于已有研究结果显示 DM1 患者的肌肉干细胞存在缺陷，研究人员对三基因杂合突变和四基因杂合突变小鼠的肌肉干细胞进行了相应的分析，结果显示，两种小鼠的肌肉干细胞数量和增殖能力与正常小鼠相比没有明显差异，但是肌肉干细胞的干性显著降低，从而导致肌肉分化的缺陷。全基因组转录分析及可变剪切分析（QY球友会生物提供）提示干细胞阶段分化基因的过早表达导致干细胞特性部分丧失，可能是突变体 MuSCs 体内外分化潜能降低的原因。研究人员进一步建立了促进肌肉干细胞分化的小分子筛选系统，发现 T5381948 在细胞水平上能缓解肌肉分化异常表型，为进一步开展大规模 DM1 药物筛选研究奠定了基础。

该研究开发了一种新策略，通过半克隆技术快速构建多基因杂合突变小鼠模型来模拟 DM1 的多数表型，一定程度上证明了 Dmpk 中 CTG 重复序列的异常扩增会导致多个基因表达水平下调从而诱发 DM1 的复杂病理表型，这些模型的建立为深入研究 DM1 的发病机理和进行药物筛选奠定了基础。